电子烟调味烟液气溶胶在Calu-3 3D肺模型中的毒理学评估

前言

电子烟自问世以来，其作为传统卷烟替代品的角色一直备受争议。一方面，电子烟被英国公共卫生部门等机构视为有效的戒烟辅助工具；另一方面，电子烟在青少年中的流行、调味成分的吸入安全性未知等问题引发广泛担忧。这种争议的核心在于：电子烟相比传统卷烟“减害”的程度究竟有多大？调味成分在其中扮演什么角色？

传统的毒理学评估多采用浸没式细胞培养——将细胞完全浸泡在含测试物的培养基中。然而，这种暴露方式无法模拟吸入暴露的真实场景：在生理条件下，肺上皮细胞的顶侧直接暴露于空气，而非液体。这种差异会改变细胞行为、形态特征及其对外源物的反应，使浸没式模型的预测价值受限。气-液界面（ALI）培养则通过在多孔膜上培养细胞、移除顶侧培养基的方式，使细胞顶侧暴露于空气或气溶胶，从而更贴近生理状态。

在此背景下，Effah等人在前期高通量筛选的基础上，利用ALI培养的Calu-3细胞构建3D肺模型，系统评估了三种调味电子烟烟液及其气溶胶的毒性，并与传统卷烟（3R4F参比烟）进行对比。

研究背景与目的

1. 前期工作基础

研究团队此前对53种无尼古丁调味烟液进行了高通量毒性筛选（浸没式培养，人支气管上皮细胞HBEC-3KT），从中鉴定出3种表现出剂量依赖性毒性且独立于PG/VG载体组分的调味烟液：肉桂、榛子和香草烟草。

2. 现有研究的局限

作者指出，既往调味烟液毒性研究普遍存在三个问题：1）缺乏合适的对照以分离调味成分的特异性危害；2）使用的剂量缺乏生理相关性；3）未证明剂量-反应关系。此外，加热烟液产生的气溶胶可能释放挥发性有机化合物和热解产物，其毒性可能与液态烟液不同。

3. 本研究的两大目标

1. 模型验证：将Calu-3细胞在ALI条件下培养28天，通过TEER测量、分化标志物基因表达（RT-qPCR）和黏蛋白染色验证其作为3D肺模型的适用性，并首次系统记录这些标志物在28天内的时程变化
2. 毒性评估：利用验证后的模型，评估上述三种调味烟液气溶胶对支气管上皮屏障功能（TEER）和细胞毒性（LDH）的影响，并与3R4F卷烟烟雾对比

材料与方法

1. 细胞模型建立与验证

细胞系：Calu-3（人支气管腺癌上皮细胞系，来源于黏膜下腺体）。该细胞系能够形成紧密连接并分泌黏液，是吸入药物毒理学研究中广泛使用的体外模型。

培养方式：在6孔PET Transwell插件（0.4 μm孔径，24 mm直径）上以ALI方式培养28天。

验证指标：

TEER：使用EVOM2伏特欧姆计测量跨上皮电阻，反映紧密连接完整性和屏障功能
基因表达：RT-qPCR检测杯状细胞标志物（MUC5AC、MUC5B）、纤毛细胞标志物（FOXJ1）、基底细胞标志物（TP63、KRT5、ITGA6）、紧密连接标志物（TJP1）
免疫荧光：MUC5AC黏蛋白染色（ImageXpress Pico数字共聚焦显微镜）

2. 气溶胶发生与暴露

电子烟气溶胶：使用自研电子烟烟液气溶胶发生器，按照CORESTA方案（5秒抽吸，30秒间隔，0.5小时共60口），功率12W，线圈电阻1.8-2.0Ω。

卷烟烟雾：使用Heinr. Borgwaldt吸烟机产生3R4F参比卷烟烟雾。

暴露方式：ALI细胞置于Thermolyne培养箱中，气溶胶经HEPA过滤空气（4 L/min）稀释后分散于培养箱内，依靠重力沉降和扩散到达细胞表面。

3. 毒性检测

屏障功能：TEER测量（EVOM2）
细胞毒性：LDH释放检测（Roche试剂盒，BIO-TEK synergy HT读板机）
氧化应激：ROS检测（H₂DCFDA荧光探针，仅浸没式培养；Spectramax M2e读板机）

4. 气溶胶粒径分布

使用Mercer型撞击器（SMEIMA7）配合Gast泵（4.0 L/min）采集，微量天平（MT5，1 μg精度）称重。

主要发现

1. Calu-3 ALI模型的成功验证

TEER变化呈双相模式：

第0-6天：从<1000 Ω·cm²快速上升至约2500 Ω·cm²（紧密连接形成）
第6-24天：维持在1800-2500 Ω·cm²之间
第24-28天：第二次快速上升至约3000 Ω·cm²

基因表达的时间依赖性变化（第0-28天）：

MUC5AC ↑ ~13倍，MUC5B ↑ ~400倍（黏液分泌细胞分化）
FOXJ1 ↑ ~4倍（纤毛细胞标志物）
TP63 ↑ ~3倍（基底细胞标志物）
TJP1 ↑ ~2.5倍（紧密连接）
KRT5 ↓（基底细胞在分化过程中减少）
ITGA6 维持不变（基底细胞修复能力维持）

免疫荧光：第21天确认MUC5AC黏蛋白表达，证实黏液分泌表型的建立。

这是首次系统报道Calu-3细胞在28天ALI培养过程中分化标志物的时程变化，首次描述基底细胞标志物在Calu-3分化中的表达模式。

2. 烟液直接暴露 vs 气溶胶暴露的差异

关键发现：

1. 烟液与气溶胶毒性不一致：香草烟草烟液降低TEER，但其气溶胶无毒性；肉桂和榛子气溶胶具有显著细胞毒性
2. PG/VG本身具有显著毒性：PG/VG气溶胶单独即导致TEER显著降低和LDH约2倍增加，与3R4F卷烟烟雾相当
3. 调味成分未显示额外毒性：肉桂和榛子的毒性效应与PG/VG对照无统计学差异

3. 气溶胶粒径分布

香草烟草虽与PG/VG粒径分布相似，但无细胞毒性，表明粒径分布并非毒性的唯一决定因素。

研究与实践启示

科学层面的启示

ALI模型应作为吸入毒理学评估的标准工具
浸没式培养的局限性已被充分证明，ALI暴露应成为气溶胶毒性评估的基准方法
PG/VG毒性的重新审视
PG/VG并非惰性载体，其气溶胶本身具有显著的细胞毒性，这挑战了“电子烟仅调味成分有害”的简化认知
调味成分的评估需在气溶胶形态下进行
烟液与气溶胶的毒性可能不同，法规测试应基于气溶胶暴露而非烟液直接暴露
区域特异性模型的重要性
不同气道区域的细胞对气溶胶的反应存在差异，评估应覆盖咽部、支气管和远端气道模型

监管与实践层面的启示

1. 电子烟的“减害”声称需要重新评估：PG/VG气溶胶与卷烟烟雾相当毒性的事实，要求对电子烟的相对风险进行更审慎的评估
2. 调味成分需个案评估：不同调味成分的毒性差异显著，不能一概而论
3. 用户知情权：应告知电子烟使用者PG/VG本身可能具有吸入毒性

国产设备推荐

本研究所用的核心设备——电子烟烟液气溶胶发生器和ALI细胞暴露系统——德伯科技均有对应产品

电子烟香烟烟雾发生器

德伯电子香烟烟雾发生器E-ASG能兼容常规电子烟、电子烟电池杆、电子烟雾化器等，精确的控制每口的抽吸容量及设定相关参数。其原理是设置好每口抽吸容量、抽吸时间、抽吸间隔时间、循环次数等参数后对电子烟一吸一停如此反复循环，持续产生香烟烟雾。

德伯ALI细胞暴露系统

德伯多通道细胞暴露染毒系统ACP6，是采用气液界面（ALI,Air liquid interface）技术在体外建立模拟体内真实环境的肺模型系统，即在体外建立具有和体内具有近似条件的肺模型，如细胞底部在液体环境中顶部暴露在气体环境，具有恒温恒湿系统，具有体内近似的分级气管，且气液界面细胞表面气流为持续流动等等所有控制都完全模拟体内肺环境。

同时，所有通道采用具有重复性更好的径向对称分布式气路及结构设计，即所有暴露细胞小室（transwell）均处于一个完全径向对称分布的圆上，暴露的气溶胶通过中央进气口被等量吸入至每一个小室内，在小室内细胞气液界面处持续通过细胞表面，真正模拟人类肺内气体交换过程。

本研究的发现挑战了“电子烟仅调味成分有害”的简化认知，强调了对PG/VG载体毒性的重新审视。未来研究应使用更敏感的原代或永生化细胞模型，结合ALI暴露和组学方法，全面评估电子烟气溶胶的健康风险。

原文信息
Effah, F., Adragna, J., Luglio, D., Bailey, A., Marczylo, T., & Gordon, T. Toxicological assessment of E-cigarette flavored E-liquids aerosols using Calu-3 cells: A 3D lung model approach. Toxicology, 500, 153683.

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